|
|
Interakční partneři proteinu eIF4E2 v lidských buňkách
Pospíšilová, Klára ; Pospíšek, Martin (vedoucí práce) ; Hálová, Martina (oponent)
Protein eIF4E2 patří do rodiny eukaryotních translačních iniciačních faktorů 4E, za běžných okolností se ale iniciace translace neúčastní. Jeho hlavní úloha spočívá v represi translace specifických mRNA. Přesto se v podmínkách hypoxie eIF4E2 účastní iniciace translace jako podjednotka specific- kého translačního iniciačního komplexu. Přesný mechanismus působení eIF4E2 ani v jednom z procesů není znám. Jedním ze způsobů, jak roli eIF4E2 v buňce prostudovat, je zjistit, s jakými dalšími proteiny eIF4E2 interaguje. Cílem práce bylo vyhledat pomocí imunoprecipitace následované hmotnostní spek- trometrií potenciální interakční partnery eIF4E2 v buňkách linie HEK293. Kromě individuálních pro- teinů bylo cílem také identifikovat proteinové komplexy, jejichž součástí je v buňkách linie HEK293 faktor eIF4E2. Druhým směrem práce byla příprava systému pro hledání inhibitorů interakce eIF4E2 s eIF4G3. Hlavním výsledkem práce je nalezení potenciálních nových interakčních partnerů eIF4E2 v lidských buňkách.
|
|
|
Minoritní proteiny viru hepatitidy typu C
Zeman, Jakub ; Vopálenský, Václav (vedoucí práce) ; Horníková, Lenka (oponent)
Virus žloutenky typu C (HCV) je hlavním původcem chronických onemocnění jater. Po celém světě je v současnosti více než 170 milionů chronicky infikovaných osob, u více jak 100 tisíc z nich se ročně rozvine hepatocelulární karcinom. HCV náležící do čeledi Flaviviridae je obalený jednořetězcový RNA virus s pozitivním vláknem (+ssRNA virus), jehož genom kóduje polyproteinový prekursor, z kterého vzniká pro štěpení buněčnými a virovými proteasami 10 virových proteinů. Mimo to je však virem kódován ještě minoritní protein v alternativním čtecím rámci. Tento protein vzniká v několika možných variantách posunem čtecího rámce či iniciací translace na vnitřních startovacích kodonech. Přes deset let výzkumu není jeho role in vivo v současné době známa. Ukazuje se, že pro robustní virovou translaci a replikaci jsou spíše než přítomnost minoritních proteinů důležité sekundární struktury v core oblasti genomu HCV. Mutace narušující tyto struktury můžou mít za následek zpomalení kinetiky virového cyklu, ale i, jak naznačuje nejnovější studie, zcela neobvyklý sérologický profil u pacientů a zvýšenou míru exprese minoritního proteinu.
|
|
|
Funkce mTORC1 komplexu v regulaci iniciace translace.
Holásková, Lucie ; Feketová, Zuzana (vedoucí práce) ; Čáp, Michal (oponent)
Práce se zabývá charakteristikou mTOR a jeho účasti na regulaci iniciace translace. Především se zaměřuje na ovlivnění iniciace translace. mTOR protein je součástí dvou komplexů, které se v organismech vyskytují - mTORC1 a mTORC2. Eukaryotický iniciační faktor 4E (eIF4E) hraje důležitou roli při kontrole iniciace translace. Aktivita eIF4E proteinu je regulována represorovými proteiny z rodiny 4E binding proteins (4E-BPs). Navázání těchto proteinů na eIF4E je regulováno stavem jejich fosforylace. Aby došlo k uvolnění 4E-BP1 z eIF4E musí dojít k fosforylaci na čtyřech fosforylačních místech (Thr37, Thr46, Ser65 a Thr70). Práce přináší formou rešerše i přehled některých dalších dějů, které se u mTOR dráhy vyskytují.
|
|
|
Hledání lidských bílkovin ovlivňujících funkci IRES viru hepatitidy typu C
Roučová, Kristina ; Pospíšek, Martin (vedoucí práce) ; Kuthan, Martin (oponent)
Virus žloutenky typu C (HCV) představuje celosvětově rozšířený patogen infikující až 3 % lidské populace. V posledních letech se výzkum nových léčiv proti tomuto viru zaměřuje na jednotlivé kroky v jeho životním cyklu, mimo jiné na iniciaci translace. V případě HCV je iniciace translace závislá na vnitřním vazebném místě pro ribozóm (IRES) a kromě složek translačního aparátu se na ní podílí i další buněčné komponenty tzv. IRES trans-účinkující faktory (ITAF). Tato práce navazuje na předchozí výzkum naší laboratoře zaměřený na hledání nových ITAF. Pro hledání potenciálních ITAF zvyšujících aktivitu IRES HCV byly připraveny nové rekombinantní plazmidové vektory, nové referenční kvasinkové kmeny a byly optimalizovány selekční podmínky připraveného sytému. Rozdíly v růstových vlastnostech referenčních kmenů byly zkoumány a kvantifikovány v selekčních i neselekčních podmínkách. Dále byla provedena série pilotních vysokovýtěžkových transformací kvasinkového kmene pJ69-4A, nesoucího bicistronní konstrukt s IRES HCV, lidskou expresní cDNA knihovnou s cílem optimalizovat transformační účinnost a selekční podmínky a v neposlední řadě i s cílem pokusit se identifikovat nové ITAF. Několik desítek náhodně vybraných klonů získaných v selekčních podmínkách z těchto transformací bylo podrobeno analýze růstových vlastností,...
|
|
|
Studium a podjednotky lidského translačního iniciačního faktoru 3 (eIF3) metodou RNA interference.
Peclinovská, Lucie ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Martínková, Markéta (oponent)
Iniciace translace je klíčovým krokem proteosyntézy, který umožňuje regulaci genové exprese. Regulace na úrovni přepisu mRNA je nejrychlejším možným mechanismem. Celý proces je ovlivňován mnoha iniciačními faktory. Jedním z eukaryotických iniciačních faktorů, který participuje na celé řadě procesů během iniciace translace je eIF3. Za jeho velice efektivní, a pro iniciaci translace nezbytnou, alespoň v kvasinkách, byla označena největší podjednotka p170, též nazývaná eIF3a. Tato práce si klade za cíl, utvořit komplexní náhled na eIF3a, přičemž hodlá vycházet z poznatků nabytých sledováním této podjednotky v Saccharomyces cerevisiae. Snížení exprese eIF3a, které umožňuje pozorovat vliv této podjednotky pomocí různých experimentů v porovnání s kontrolní skupinou, je "navozeno" metodou RNA interference. Na eIF3a je zde nahlíženo z pohledu i) životaschopnosti buněk metodou využívající 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyl- -tetrazolium bromid (MTT testu) ; ii) sleduje se vliv podjednotky na celkovou expresi proteinu inkorporací 35 S-methioninu a iii) v neposlední ředě je v této práci ukázán vliv snížené exprese eIF3a na tvorbu polysomů.
|
|
|
Příprava kvasinkového systému pro studium lidské iniciace translace
Holásková, Lucie ; Pospíšek, Martin (vedoucí práce) ; Cuchalová, Lucie (oponent)
Iniciace translace je vysoce regulovaný proces. Významnou roli v něm hraje komplex eIF4F, který se skládá z 3 podjednotek - eIF4A, eIF4E a eIF4G. Protein eIF4E se váže na 7-methylguanozinovou čepičku na 5' konci mRNA, helikáza eIF4A rozvolňuje sekundární struktury na mRNA a kostru tvoří protein eIF4G. Spolupráce s dalšími iniciačními faktory je důležitá pro zahájení tvorby proteinů. Cílem mé práce bylo přispět k vytvoření kvasinkového kmene Saccharomyces cerevisiae s humanizovaným eIF4F faktorem. Nejprve jsem nahradila protein eIF4E kvasinky Saccharomyces cerevisiae za lidský protein eIF4E. S využitím delečních kazet a cre/loxP rekombinace jsem připravila kmeny s delecemi v genech eIF4GI (huΔ4G1) a eIF4GII (huΔ4G2). Charakterizace nově získaných kmenů překvapivě ukázala, že lidský eIF4E protein nahrazuje odpovídající kvasinkový orthologní faktor lépe než eIF4E z evolučně výrazně bližší Candida albicans. Pilotní pokusy s nově získanými kmeny a s kmeny závislými na eIF4E z Candida albicans též ukázaly na možný význam kvasinkového eIF4GII pro růst buněk během teplotního a osmotického stresu. Klíčová slova: iniciace translace, eIF4E, eIF4G, Saccharomyces cerevisiae
|
|
|
Příprava a využití systému pro studium regulace genové exprese kvasinkových lineárních cytoplasmatických plasmidů
Horáčková, Kamila ; Vopálenský, Václav (vedoucí práce) ; Čáp, Michal (oponent)
O translaci lineárních cytoplasmatických plasmidů vyskytujících se u kvasinky Kluyveromyces lactis existují pouze velmi kusé informace. V současné době je poměrně dobře prozkoumán jejich transkripční aparát i celý transkriptom. Studium transkriptů lineárních plasmidů odhalilo velmi netypické uspořádání jejich 5ʼ konců, které obsahují netemplátovou polyadenylaci a postrádají N7 methylguanosinovou čepičku. Právě přítomnost této struktury na 5ʼ konci plasmudů specifických mRNA vyvolalo otázku iniciace translace. Tato práce se zabývala přípravou reportérového systému vhodného pro studium vlivu počtu netěmplátově přidaných adenosinů na 5ʼ konec mRNA lineárních plasmidů. Prvním krokem byla konstrukce duálního kvasinkového plasmidu nesoucího dva reportérové geny pod kontrolou dvou různých promotorů. Po jeho úspěšné konstrukci byla měřena aktivita promotorů TEF1 a PGK1, kdy se promotor TEF1 ukázal cca dvakrát silnější. Rovněž byl stanoven transkripční start obou promotorů. Druhým krokem byla konstrukce reportérového systému rovnou v kvasinkových plasmidech pGKL. Reportérové geny byly pod kontrolou dvou promotorů pocházejících z pGKL plasmidů iniciujících vznik trankriptů s různou strukturou. Po měření síly promotorů se ukázalo, že jejich síla je v porovnání s promotory TEF1 a PGK1 velmi nízká, až...
|
|
|
4E translation initiation factors and their influence on regulation of gene expression
Lettrich, Patrik ; Mašek, Tomáš (vedoucí práce) ; Převorovský, Martin (oponent)
Translácia predstavuje jeden z najdôležitejších procesov odohrávajúcich sa v bunke. To je dôvodom, prečo je častým terčom rôznych regulácií. Obzvlášť dôležitú úlohu pre regulačné procesy je jej iniciačná fáza. Ku iniciácii translácie dochádza väčšinou po rozpoznaní a špecifickej väzbe kanonického eukaryotického iniciačného faktoru 4E1 (eIF4E1) na metylguanozínovú čiapočku prítomnú na 5' konci väčšiny eukaryotických mRNA. Rodina translačných iniciačných faktorov 4E však obsahuje ďalších dvoch členov - eIF4E2 a eIF4E3. Tieto dva proteíny tiež disponujú funkčnou schopnosťou viazať čiapočku mRNA, čo ich predurčuje k regulačným funkciám v súvislosti s transláciou. Proteín eIF4E2 je známy ako translačný represor vo vývojových procesoch a podieľa sa aj na umlčovaní génov sprostredkovanom miRNA. Existujú dôkazy o tom, že je schopný iniciovať transláciu v hypoxických podmienkach, čo je v zhode s jeho dokladovanými funkciami v hypoxických nádorových bunkách. Biologické úlohy proteínu eIF4E3 sú podstatne menej preskúmané. Táto práca podáva obraz o fungovaní všetkých troch translačných iniciačných faktorov s využitím bunkových línií s ich nadprodukciou alebo naopak deléciou. Experimentálne dáta potvrdili úlohu eIF4E2 v regulácii vývojových procesov. Bunkové línie s deléciou eIF4E2 a eIF4E3 boli...
|
|
|
Binding of eIF3 in complex with eIF5 and eIF1 to the 40S ribosomal subunit is accompanied by dramatic structural changes
Zeman, Jakub
Eukaryotické iniciační faktory (eIF) jsou pro průběh eukaryotické translace minimálně stejně důležité jako ribosom. Některé tyto faktory mají rozdílné úlohy napříč celou translací v zajištění korektního složení preiniciačního komplexu na mRNA, přesném výběru iniciačního kodonu, bezchybné produkci příslušného polypeptidu a jejím řádném ukončení. Patrně nejdůležitějším z těchto faktorů je eIF3, který integruje signály od ostatních faktorů a koordinuje jejich funkci na ribosomu. V případě Saccharomyces cerevisiae je eIF3 tvořen pěti podjednotkami. Všechny tyto podjednotky obsahují strukturní motivy zodpovědné za kontakt s ribosomálními proteiny a molekulami RNA. Kromě těchto vysoce strukturovaných částí je zbytek eIF3 nestrukturovaný a velmi flexibilní. Z toho důvodu nejsou i přes současný pokrok v kryoelektronové mikroskopii doposud známy ani přesná struktura eIF3, ani jeho přesná poloha na ribosomální podjednotce 40S. Rovněž přítomnost eIF3 na ribosomu 80S během časné elongace a role eIF3 v reiniciaci a pročítání stop kodonu nejsou zatím zcela prostudovány. K rozluštění těchto tajemství eIF3 jsme použili rentgenovou krystalografii, chemické zesítění spojené s hmotnostní spektrometrií a rozličné biochemické a genetické metody. Naše práce ukazuje, že je eIF3 velmi kompaktně sbalený, pokud se nachází...
|
|
|
Interakční partneři proteinu eIF4E2 v lidských buňkách
Pospíšilová, Klára ; Pospíšek, Martin (vedoucí práce) ; Hálová, Martina (oponent)
Protein eIF4E2 patří do rodiny eukaryotních translačních iniciačních faktorů 4E, za běžných okolností se ale iniciace translace neúčastní. Jeho hlavní úloha spočívá v represi translace specifických mRNA. Přesto se v podmínkách hypoxie eIF4E2 účastní iniciace translace jako podjednotka specific- kého translačního iniciačního komplexu. Přesný mechanismus působení eIF4E2 ani v jednom z procesů není znám. Jedním ze způsobů, jak roli eIF4E2 v buňce prostudovat, je zjistit, s jakými dalšími proteiny eIF4E2 interaguje. Cílem práce bylo vyhledat pomocí imunoprecipitace následované hmotnostní spek- trometrií potenciální interakční partnery eIF4E2 v buňkách linie HEK293. Kromě individuálních pro- teinů bylo cílem také identifikovat proteinové komplexy, jejichž součástí je v buňkách linie HEK293 faktor eIF4E2. Druhým směrem práce byla příprava systému pro hledání inhibitorů interakce eIF4E2 s eIF4G3. Hlavním výsledkem práce je nalezení potenciálních nových interakčních partnerů eIF4E2 v lidských buňkách.
|
host ::
RSS.